Home Публикации Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток ...

ПРИМЕНЕНИЕ АУТОЛОГИЧНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ
СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ
СВОБОДНОЙ КОСТНОЙ ПЛАСТИКЕ.

(экспериментально-морфологическое исследование)

Авторы:
Сысоев С. Д., д.м.н. Орлов А.А., Сабурина И.Н., Григорян А. С.,
Репин В.С., Григорьянс Л.А.


Федеральное государственное бюджетное учреждение « Научно- исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук, 125315, Москва, ул. Балтийская, 8

ГБУЗ ГП№ 170 ДЗМ

Федеральное государственное бюджетное учреждение « Центральный научно- исследовательский институт стоматологии и челюстно- лицевой хирургии» , 119991, Москва, ул. Тимура Фрунзе , 16
ГП №62, Южного административного округа г. Москвы

Ключевые слова. Аутогенные стволовые клетки из жировой ткани, стимуляция остеогенеза, костный аутотрансплантат.
Реферат. В экспериментах на 48 крысах линии Вистар с помощью гистомоморфологического метода прослежена динамика остеогенетического процесса в области аутокостного трансплантата из большеберцовой кости при его фиксации на поверхности нижней челюсти и введении в область операции взвеси из аутогенных стволовых клеток из жировой ткани в первой группе животных (основная группа), и без введения МСК во второй группе (группе сравнения). Сроки наблюдений: 21, 60, 120 и 180 суток, по 6 крыс на точку наблюдений в каждой из групп.
Проведенное исследование продемонстрировало выраженную интенсификацию остеогенетического процесса в основной группе опыта, и как следствие этого, слияние костных образований в единое целое. В группе сравнения во все сроки наблюдений между аутокостным трансплататом и нижнечелюстной костью обнаруживались обширные поля грубоволокнистой соединительной тканью .
INFLUENCE OF TRANSPLANTATION OF АUТОGENIC МЕZENHYMAL STEM CELLS FROM THE FATTY TISSUES ON OSSEOGENIC PROCESS
(experimental and morphological research)

Keywords. Autogenic mezenchymal cells from an adipose tissue, stimulation bone formation, osseo genesis, bone graft.
The abstract. In experiments on 48 rats of line Wistar, divided at 2 groups (first – basic group and 2-d group – group of comparison) through the use of morphological method was researched influence of mesenchymal stem cells (MSC) inoculated in the arrear of autogenic bone graft from tibia fixed at the surface of the jaw. The animals of group of comparison didn’t get MSC. Time frames of watching: 21, 60, 120 and 180 days, 6 rats on the point of experiment in either of the two of the group.
Data of this research had shown the intensification of bone formation process in the basic group of experiment under the action of the inoculation of autogenic MSC from adipose tissue, and as consequence of it, in eventual, merge of bone formations in a single entity.


Введение

В КОНЦЕ 19 ВЕКА BARDENHEUER /1892/ И WILDT /1892/ ПРОИЗВЕЛИ ОСТЕОПЛАСТИКУ НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ АУТОТРАНСПЛАНТАТАМИ, ПОЛОЖИВ НАЧАЛО КОСТНО-ПЛАСТИЧЕСКИМ ОПЕРАЦИЯМ ЧЛО. В НАСТОЯЩЕЕ ВРЕМЯ ПРАКТИКУЮЩИМ ХИРУРГАМ ПРИХОДИТЬСЯ СТАЛКИВАТЬСЯ С ДЕФЕКТАМИ РАЗЛИЧНЫХ ОБЬЕМОВ, И УСТРАНЕНИЕ ИХ ТАК ЖЕ ЯВЛЯЕТЬСЯ СЛОЖНЫМ КЛИНИЧЕСКИМ ПРОЦЕССОМ НЕ ВСЕГДА ДАЮЩИЙ УДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ. А.Я. ФРИДЕНШТЕЙН И СОАВТ. [1] ОПИСАЛИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ (МСК) КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА, КОТОРЫЕ РАССМАТРИВАЮТСЯ КАК ОСНОВНЫЕ ИСТОЧНИКИ КЛЕТОЧНОГО ПУЛА ДЛЯ ПОСТОЯННОГО ОБНОВЛЕНИЯ И РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ. РЕШАЮЩИМ ВКЛАДОМ В РАЗВИТИИ ЭТОГО НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ЯВИЛИСЬ РАБОТЫ CAPLAN И СОАВТ., ПРОДЕМОНСТРИРОВАВШИХ ОБРАЗОВАНИЕ ЭКТОПИЧЕСКИХ ОЧАГОВ КОСТЕОБРАЗОВАНИЯ И РЕЗКОЕ УСКОРЕНИЕ ЗАЖИВЛЕНИЯ ОБШИРНЫХ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ ПРИ ИНОКУЛЯЦИИ ЖИВОТНЫМ МСК [2].

За минувшее время клеточные технологии шагнули далеко вперёд. Были разработаны новые методы и источники получения стволовых клеток в том числе из жировой ткани, что актуально в свете настоящего исследования.
Если в прошлом чуть ли не единственным источником для МСК признавался костный мозг, то в последние гноды речь идёт о том, что МСК располагаются практически во всех тканевых субстратах взрослого человека и животных. Они обнаружены т выделены из жироворй ткани, скелетных мышц, связок, из трабекулярной кости [3].
Эти данные в определённой степени поддерживают концепцию существования мультилинеарного резерва в виде стволовых клеток на протяжении постнатальной жизни человека и животных [3].
Раскрыты тонкие (на молекулярном уровне) механизсы работы МСК и тех взаимодействий, которые осуществляются при их непосредственном участии [4] и [5].
Проведенное нами исследование направлено на решение актуальной задачи современной травматологии и ортопедии стимуляции остеогенетического процесса при дефиците костной ткани, в том числе в области альвеолярного отростка челюсти, что актуально для ортопедической стоматологии.

Цель исследования.
Совершенствование средств и методов лечения дефицита костной ткани в области альвеолярного отростка посредством использовании липогенных МСК и костного аутотрансплантата.

Задачи исследования.

  1. Исследовать с помощью гистоморфологического метода динамику развития костеобразовательного процесса в области трансплантации подопытным животным (крысы) аутотранс-плантата из большеберцовой кости на поверхность нижней челюсти при инокуляции им в область операции аутогенных МСК из жировой ткани.
  2. Рассмотреть на основе результатов собственных наблюдений степень влияния инокуляции МСК на активность клеточных элементов участвующих в остеогенетическом процессе.
  3. Исследовать характер и выраженность таких компонент регенерации как пролиферация остеогенных клеток и их созревание, а так же процессов резорбции костного вещества, и перехода структуры костного матрикса от грубоволокнистого характера к пластинчатому в условиях проводимого эксперимента.
  4. Проследить в сроки от 21 до 180 суток характер процессов новообразования и ремоделирования вновь образованной костной ткани при введении подопытным животным липогенных МСК в области трансплантации подопытным животным костного аутотрансплантата при инокуляции им в область операции аутогенных МСК из жировой ткани.
  5. Экспериментально обосновать целесообразность и эффективность применения в хирургической стоматологии и челюстно- лицевой хирургии аутогенных МСК из жировой ткани на этапах подготовки пациентов к дентальной имплантации.

При анализе гистологических картин мы стремились провести оценку костеобразовательного процесса в области контакта аутокостного материала и материнской кости посредством определения интенсивности костеобразовательного процесса по:
а. активности образования новых костных трабекул;
б. гистологической характеристике остеобластов (с точки зрения проявления их функциональной активности);
в. по наличию напластований новообразованных костных трабекул на костные фрагменты, как проявление остеогенетической активности;
г. по степени зрелости новообразованных костных структур на этапах экспериментальных наблюдения.

Материал и методы исследования

Выделение МСК жировой ткани.
Образцы жировой ткани выделяли из паховой области животных, гомогенизировали и разводили втрое фосфатным буфером Дульбекко (ФБД) и интенсивно встряхивали на вортексе в течение 2-3 мин. После центрифугирования (10 мин при 6ООg) жировое кольцо и супернатант удаляли, а осадок из стромальных клеток ресуспендировали в среде культивирования.
Клеточные суспензии разводили вдвое фосфатным буфером Дульбекко (ФБД) и наслаивали на градиент плотности Histopaque 1.077 ("Sigma").
После центрифугирования в течение 30 мин при 400g интерфазные мононуклеарные кольца отбирали в отдельные пробирки и отмывали центрифугированием в избытке ФБД. Полученные клеточные осадки ресуспендировали в среде культивирования и высевали во флаконы (Т25; "Coming").

Культивирование МСК жировой ткани.
Среду с неприкрепившимися клетками удаляли, культуры бережно отмывали ФБД и заменяли среду культивирования на свежую. Дальнейшие смены среды проводили через 2-3 сут. По мере роста и достижения субконфлюентного состояния клетки снимали трипсином-ЭДТА ("Gibco") и пересевали в новые флаконы с разведением 1:3-1:10. Использовали культуры 3-7 пассажей.

Методика эксперимента.
Эксперимент был проведен на 48 крысах линии Вистар, массой 200-220 Г. Животных разделили на 2 равные группы: основную группу и группу сравнения.
Способ введения МСК: 1-е введение в день операции посредством инъекции в область операции, 2-е введение - на 10-е сутки после операции, область операция обкалывали в 4-х точках.
Количество МСК на 1 введение на крысу составляло 3,5 - 6,7 Х 106 В 0,4 мл физиологического раствора.

Первый хирургический этап
Забор аутотрансплантата из правой большеберцовой кости (Tibia). Наркоз: кетамин с ксилазином (1:1 по объему в одном шприце) из расчета 0,15 мл препарата на 100 грамм веса животного. Операционное поле освождалось от шенсти. Производили разрез по передней поверхности голени от дистальной части симфиза коленного сустава над Tibia длиной приблизительно 1,5 см. Далее - рассечение футлярно-надкостничной перемычки верхней трети Tibia. Производили скелетирование участка кости 2х2 мм фрезой с охлаждением (физраствор) на глубину 1,5 мм. Выпиливали участок кости (аутотрансплантат). Костный дефект в Tibia пломбировали хирургическим воском BONEWAX фирмы Ethicon.
Аутотрансплантат помещали в стерильный физиологический раствор. Рану послойно ушивали (Викрил 5,0). По ходу операции проводили гемостаз.

Второй хирургический этап
На втором этапе производили пересадку свободного аутотрансплантата Tibia на наружную поверхность тела и ветви нижней челюсти с его фиксацией титановым микровинтом (L 5 м, D 1,2 мм).
Проводили разрез кожи и подкожно-жировой клетчатки по краю тела нижней челюсти слева. Тупым путем отводили в стороны поверхностно и глубоко лежащие сосуды. Далее расслаивали жевательную мышцу, скелетировали наружную поверхность области тела и ветви нижней челюсти и производили остеоабразию в этой области размером 3х3 мм. Создавали перфорационное отверстие в кости нижней челюсти и в аутотрансплантате с охлаждением (физраствор). Аутотрансплантат фиксировали титановым винтом. При этом красный костный мозг аутотрансплантата контактировал с воспринимающим ложем нижней челюсти. Рану послойно ушивали (Викрил 5,0). По ходу операции осуществляли гемостаз.
Животным внутримышечно вводили антибиотик Байтрил (Эндофлоксацин) 5% по 0,1 мл на животное из расчета примерно 10 мг/кг. В дальнейшем антибиотик вводили повторно на 2 сутки после дня операции.
Животных выводили из эксперимента на 21, 60, 120 и 180 сутки после операции по 3 животных на точку наблюдения.

Методика гистологического исследования
Выделяли костные образования из области операции и фиксировали их в 10% нейтральном формалине. Костную ткань декальцинировали в 25% Трилоне Б и заливали в парафин. Готовили серийные срезы. Окраска гематоксилин-эозином и по Ван-Гизон.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Как показало проведенное исследование в сроки 21 сутки опыта ведущим процессом в области трансплантации аутокостного материала на челюстную кость с инокуляцией в область операции аутогенной культуры МСК, полученной из жировой ткани, явился процесс активного остеогенеза в зоне трансплантации, причём как в области материнской кости, так и по краям аутотрансплантата, а так же костных осколков

Рис. 1

Основная группа. 21 сутки опыта. Новообразованные костные трабекулы (одинарная стрелка) напластовываются на аутокостный трансплантат (стрелки углом), которым прилежит слой пролиферирующих остеогенных клеток. Костные трабекулы окаймлены зоной пролиферирующих остеогенных клеток (сдвоенные стрелки), охваченной слоем коллагеновых волокон. Окраска по Ван-Гизон. Х50.


Между этими зонами активного остеогенеза располагалась соединительнотканная прослойка, которая как бы разграничивала эти два «нуклеуса» клеточной остеогенетической активности.
В группе сравнения, где отсутствовало поддерживающее остеогенез воздействие МСК остеогенетическая активность либо отсутствовала, либо была чрезвычайно низкой. Помимо этого наблюдались и цитологические признаки низкой компетентности этих клеток. Они, как правило были мелкими и иррегулярными по своему расположению у краёв костных трабекул, которые в этой группе наблюдений и сами по себе были крайне скудно и нерегулярно представлены в области контакта аутокостный трансплантат – материнская кость.




Рис. 2

Группа сравнения. 21 сутки опыта. Поля рыхлой соединительной ткани в пространстве , прилежащем к аутотрансплантату. Остеобласты у костного края мелкие, дезорганизованные. Окраска по Ван-Гизон. Х100.

Исследование материала 60-х суток опыта свидетельствовало о том, что инокуляция липогенных МСК значительно повышала интенсивность образования новых костных трабекул и способствовала заполнению пространства между аутокостным трансплантатом и материнской костью новообразованным костным веществом. Вновь образованная кость проявляла тенденцию к компактизации, нередко при сохранении её грубоволокнистого характера
Отмечалось появление участков с более высоким уровнем дифференциации, вплоть до образования некоторых количеств остеонных систем, однако, ещё иррегулярных.
В одном из наблюдений отмечалось образование плотного соединения между аутотрансплантатом и материнской костью.






Рис. 3

Основная группа. 60 суток опыта. Спаивание аутотрансплантата (три стрелки) и материнской кости (стрелки углом)в результате интенсивного остеогенеза.. Новообразование остеоидных (одинарная стрелка) и более зрелых грубоволокнистых костных трабекул в пространстве между аутотрансплантатом (сдвоенные стрелки) и материнской костью (стрелки углом). Новообразованные костные трабекулы напластовываются на костные осколки (одинарные стрелки). Окраска по Ван-Гизон. Х50.

На значительных пространствах наблюдалось отложение остеоидного вещества, что свидетельствовало о чрезвычайно высокой интенсивности костеобразовательного процесса.
Вновь образованное костное вещество характеризовалось высокой насыщенностью клеточными элементами, с преобладанием молодых и активно синтезирующих остеобластов.
В группе сравнения костеобразовательный процесс был выражен очень слабо, либо отсутствовал вовсе. Клеточные элементы в группе сравнения характеризовались признаками низкой синтетической активности, они были мелкими, их количество было снижено и располагались эти клетки иррегулярно.
На 120 сутки опыта анализ гистологических картин показал, что в группе с инокуляцией МСК (основная группа) во всех случаях в пространстве между аутотрансплантатом и материнской костью формировалась новая костная ткань, которая спаивала аутокостный трансплантат и материнскую кость в единое костное образование. Новообразованная костная ткань, как правило, имело склонность к компактизации. Местами для новообразованной костной субстанции была характерна высокая насыщенность клеточными элементами, что, соответствовало характеристике этих участков как молодого низко дифференцированного костного вещества.
Даже в случае сохранения в области контакта двух костных формаций фиброзной прослойки (1 наблюдение) по его краям отмечалось интенсивное новообразование костных трабекул.
В группе сравнения отмечалась чрезвычайно низкая остеогенная активность, что, в частности, выражалось в малом количестве новых трабекул либо полном их отсутствии. Обширные территории этого пространства были заняты грубоволокнистой соединительной тканью.


Рис. 4

Группа сравнения, 180 сут. опыта. Обширная зона грубоволокнистой соединительной ткани (сдвоенные стрелки) между аутокостным трансплан-татом и материнской костью. Окраска по Ван-Гизон. Х50.

Было отмечено, что ткань аутотрансплантата не оставалась интактной, в ней происходило запустевание значительной части клеточных лакун, что должно расцениваться, как проявление альтерации.
Таким образом, речь в основной группе опытов идёт об определённой завершенности процесса дифференциации новообразованной костной субстанции. В этом состояло одно из важных следствий инокуляции в область операции на ранних этапах опыта мезенхимальных стволовых клеток. Дериваты этих клеток, по-видимому, сохранились на поверхности аутотрансплантата и проявили себя в отдаленные сроки эксперимента, детерминируя продолжение процесса остеогенеза и вторичную перестройку (ремоделирование) вновь образовавшегося в пространстве между аутокостным трансплантатом и материнской костью костного вещества.
Сопоставление результатов исследования в основной группе и группе сравнения свидетельствовало о том, что различие в группах наблюдения касаются не только количества вновь образованных костных структур, которых визуально было много больше в основной группе, но качественных характеристик нового костного вещества, которое в основной группе имела пластинчатое строение с интенсивным развитием остеонных систем.
В группе сравнения наблюдалось очень слабое или практически полное отсутствие проявлений остеогенетических процессов, как в плане новообразования костных структур, так и структурных характеристик остеобластических элементов. Их количество было снижено, они были уменьшенными в размерах и располагались вдоль костного края, зачастую изъеденного в следствие резорбции, с нерегулярными перерывами.

Заключение.
Как показало проведенное исследование, в основной группе, животным которой инокулировали в область операции липогенные МСК, начиная с 21 суток, в пространстве между аутотрансплантатом и материнской костью происходило интенсивное построение новых костных трабекул.
Цитологические характеристики остеобластических элементов, новообразованных костных структур в пространстве между материнской костью и аутотрансплантатом свидетельствовали о высокой синтетической активности этих клеток.
На 60-е сутки опыта в результате пролиферации остеогенных клеток в основной группе у костных краев наблюдалось образование широкого пласта из указанных клеток, который отграничивался от окружающих тканевых элементов тонкой соединительно-тканной пластинкой.
В основной группе опытов, начиная с 60-х суток опыта (1 животное, а в последующем у подавляющего их числа), в результате активных остеогенетических процессов, в пространстве между аутотрансплантатом и материнской костью происходило спаивание указанных костных образований в единое целое.
По мере увеличения сроков наблюдения новообразованное костное вещество в пространстве между аутокостным трансплантатом и материнской костной тканью подвергалось дифференциации, что выражалось в превращении его матрикса из грубоволокнистого в пластинчатый и развитии остеонных систем.
В группе сравнения, животным которой не вводили МСК, в пространстве между аутотрансплантатом и материнской костью формировались обширные поля фиброзной соединительной ткани, которые прослеживались во все сроки наблюдений.
Данные настоящего исследования демонстрируют высокий уровень стимулирующего действия аутогенных МСК из жировой ткани на процессы остеогенеза, что свидетельствует о целесообразности их применения при дефиците костной ткани в области альвеолярного отростка на этапе подготовки пациентов к дентальной имплантации.

Список цитируемых источников
1. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р. К. Герасимов Пролиферативный и дифференцировочный потенциал склетогенных колонеобразующих клеток костного мозга. //Цитология 1986.- Т. 28.- №3.-сс.341-349
2. Dennis J.I.Haynessworth S.E., Young R.G., Caplan A.I. Osteogenesis in marrow derived mesenhymal cellporous ctramic compositstransplanteed subcutaneously; effectof fibronectin and laminin on ctll retention and rate of osteogenesis expretion Cell. Nransplant., 1992,1(123-32)] и [Ohguslu I.I., Goldberg V.M., Caplan A.I. Heterotopic osteogenesis in porous ceramics induced by marrow cells. J. Orthop. Res. 1989; 7 (4)]; 568-578
3. Bianco P., Cao X., Frenette P. S. и соавт., “The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine,” Nature Medicine, 2013.-vol. 19.- pp. 35–42] и [Phinney D. G. “Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy,” Journal of Cellular Biochemistry, 2012.-vol. 113-pp. 2806–1282.
4. Deng Z. L., Sharff K. A., K. A. Tang K. A. и соавт.., “Regulation of osteogenic differentiation during skeletal development,” //Frontiers in Bioscience - 2008 -vol. 13 - №6 - pp. 2001–2021.
5. Ducy, P. Zhang, Geoffroy R., V., Ridall A.L. и Karsenty G., “Osf2/Cbfa1: a transcriptional activator of osteoblast differentiation,” //Cell -1997-vol. 89-№.5-pp.747–754.

 

Виртуальный тур по клинике