Home Публикации Исследование цитотоксичности стоматологических имплантов

Исследование цитотоксичности стоматологических имплантов

Исследование цитотоксичности стоматологических имплантов Easy Fast S (Ti) и Easy Kon (ZrO2) in vitro


Сабурина И.Н.1,2, Колокольцова Т.Д.1,2, Кошелева Н.В.1, Зурина И.М.1, Горкун А.А.1, Орлов А.А.1
1 ФГБУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва, Россия
2 Российская медицинская академия последипломного образования, Москва, Россия
3 Академическая стоматологическая клиника, Москва, Россия

Введение
Одним из важных методов современной стоматологии при лечении поврежденных или разрушенных зубов является использование композиционных материалов, в том числе стоматологических имплантов, предварительно покрытых мультипотентными стромальными клетками, применение которых рассматривают, как одно из перспективных направлений в костной регенеративной медицине (Zigdon, Levin, 2012). Клинические наблюдения показали, что часто без внутриканального штифта невозможно провести реставрацию коронковой части зуба. Штифтовые зубы известны очень давно. Уже в начале XVIII века (1728 г.) Пьер Фошар применял их. Несмотря на большое разнообразие штифтовых конструкций, эффективно используемых в настоящее время в стоматологической практике, их совершенствование продолжается (оптимизируются формы и состав). Важную роль играют материал, рельеф поверхности стоматологических штифтов, а также минимизация потенциальных цитотоксических эффектов.

В последние годы большое распространение получили штифты из титана (Ti) (Valencia et al., 2009, Cai et al., 2009, Giannoni et al., 2009). Альтернативным материалом для стоматологических имплантов является диоксид циркония (ZrO2), рассматриваемый как высокоперспективный, кроме того, для применения в регенеративной медицине (Neunzehn et al., 2012). Основным требованием к имплантам остается их нетоксичность и биологическая совместимость с тканями зуба, оценить которые позволяет использование клеток, выращенных in vitro. Возможность прижизненного наблюдения с помощью микроскопа делает клеточные культуры незаменимой моделью для проведения исследований в биологии, медицине, фармакологии и косметологии и также могут быть использованы для контроля цитотоксичности стоматологических штифтов.


Целью настоящего исследования стало изучение цитотоксичности стоматологических имплантов Easy Fast S (Ti) и Easy Kon (ZrO2) с использованием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:
Материалы. Исследование было проведено на коммерческих стоматологических штифтах 0483 Easy Fast S (General Implants GmbH, Germany) на титановой основе (Ti) и 0297 Easy Kon (General Implants GmbH, Germany) на основе диоксида циркония (ZrO2). Размеры имплантов: Easy Fast S – диаметр = 3,8 мм, длина = 10,0 мм; Easy Kon – диаметр = 6,0 мм, длина = 10,0 мм.
Культура клеток. Для заселения имплантов использовали культуру стромальных клеток жировой ткани человека (Human Adipose Derived Stromal Cells – hADSC), выделенную из липоаспирата, собранного во время липосакции с добровольного согласия пациентов по стандартной методике (Zuk et al., 2001, Dubois et al., 2008). Ростовая среда включала смесь DMEM/F12 в соотношении 1:1 с добавлением 2mM L-глутамина, 10% фетальной сыворотки коров и 100ед/мл гентамицина. Остеогенная индукционная культуральная среда включала ростовую среду с добавлением 10-7М дексаметазона, 10 mM глицерофосфата и 0,2 mM аскорбиновой кислоты. Клетки культивировали до формирования монослоя в ростовой среде в течение четырех пассажей, снимали с помощью 0,25%-ного раствора трипсина, суспензию клеток осаждали с помощью центрифугирования (7 минут, 1000об/мин). Работу с культурами клеток проводили в ламинарном боксе Thermo Scientific LTD, с соблюдением правил асептики.
Заселение имплантов. Перед заселением клетками импланты помещали в ростовую среду, выдерживали в ней не менее 24 часов при комнатной температуре. Затем переносили по одному в лунки стерильного 12-луночного планшета (TPP, Швейцария), предварительно заполнив пространства между лунками планшета ростовой средой для предотвращения испарения среды в лунках. Клетки после центрифугирования пипетировали и в количестве 2х105 клеток в 80 мкл остеогенной индукционной среды наносили на каждый штифт, после чего помещали в СО2 инкубатор и оставляли при 370С для адгезии клеток к поверхности имплантов. Через 80мин в каждую лунку осторожно добавляли индукционную ростовую среду в количестве до 1 мл и помещали в СО2 инкубатор. В качестве контроля для исследования сохранения остеогенной дифференцировки использовали культуру hADSC, помещенную в лунки в 1мл остеогенной среды (Контроль 1) и ростовой среды (Контроль 2).
Планшет закрывали специальной крышкой, обеспечивая условия культивирования клеток в 5% СО2 при температуре 370С и помещали в прибор Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) для длительного прижизненного наблюдения за живыми объектами (Time-lapse microscopy). Прижизненное наблюдение за жизнеспособностью, пролиферацией клеток и их фенотипом вели на протяжении всего срока эксперимента. Фиксацию образцов осуществляли через 48 часов сокультивирования с клетками.
Образцы исследовали методом сканирующей (растровой) электронной микроскопии. Часть экспериментальных и контрольных клеток (Контроль 1 ) пересевали в плотности 5*104 кл/см2 на покровные стекла (24Х24мм, Menzel, Германия), помещенные в чашки Петри (35мм, TPP, Швейцария) для последующего иммуноцитохимического анализа. Оставшиеся клетки из каждого образца в количестве 2-3*105 использовали для выделения тотальной мРНК.
Time-lapse microscopy. Для анализа клеточной пролиферации и активности планшет со штифтами и Контролем 2 помещали в Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) – прибор для длительного прижизненного наблюдения за живыми объектами. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 минут в течение 2 суток. Дальнейший анализ производили с помощью программного обеспечения Cell-IQ Analyzer.
Растровая электронная микроскопия. Фиксацию препаратов осуществляли 2,5%-ным раствором глютарового альдегида в течение 2 часов, дофиксировали в 1%-ном растворе OsO4 (2часа), обезвоживали в спиртах восходящей концентрации (2 смены по 5 мин в каждой) и ацетоне (3 смены по 10мин в каждой). Затем образцы высушивали в критической точке и перед сеансом образцы напыляли в вакууме золотом, получая реплику, повторяющую контуры образца, которую впоследствии исследовали под сканирующим электронным микроскопом CamScan (Япония).
Экпрессия мРНК. Клетки (hADSC) экспериментальных и контрольных культур лизировали, используя Trizol (Invitrogen, США). Клеточные лизаты каждого образца собирали с помощью центрифугирования и затем пипетировали. Тотальную РНК выделяли в соответствии с протоколом производителя и осаждали этанолом. С помощью MMLV RT Kit (Евроген, Россия) из каждого образца получали кДНК, которые исследовали на экспрессию TBP (ген «домашнего хозяйства»), Cbfa-1 и BMP2.
Иммуноцитохимический анализ. На 4 сутки культивирования стекла с клетками (hADSC) в ростовой и остеогенной средах трижды промывали фосфатно-солевым буфером (pH=7,4) и фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида (Sigma, USA) в течение 20 минут при +40С. Далее стекла с клетками отмывали от фиксатора и инкубировали с первичными антителами к остеокальцину (R&D Systems, USA) а затем с видоспецифичными вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом FITC (Thermo Scientific LTD, USA) в соответствии с протоколом производителя. Ядра докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид - Hoechst 33258 (Invitrogen, USA). Полученные препараты накрывали покровным стеклом, и анализировали в видимом и ультрафиолетовом световых диапазонах под лазерным конфокальным микроскопом Olympus Fluoview FV10I (Olympus, Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При визуальном осмотре внешне исследуемые импланты не отличались и представляли собой винты с ровной гладкой поверхностью (рис.1). Однако сканирующая электронная микроскопия показала значительное различие в ультраструктуре их поверхности. Поверхность циркониевого импланта 0297 выглядела более ровной и гладкой, чем поверхность титанового импланта 0483 (Рис.2). Титановый имплант имел неровную поверхность с более крупными вмятинами и порами (Рис.2 В, Г).


Рис.1 Внешний вид имплантов под инвертированным микроскопом. Увеличение Х40 об.


А) Б)
В) Г)

Рис.2. Сканирующая электронная микроскопия поверхности стоматологических имплантов при разных увеличениях.

А, Б – 0297 Easy Kon (General Implants GmbH, Germany) на основе диоксида циркония (ZrO2), В, Г - 0483 Easy Fast S (General Implants GmbH, Germany) на титановой основе (Ti).
Проведенные в системе Cell-IQ исследования показали, что штифты также различались по адгезивным свойствам. Стромальные клетки жировой ткани (hADSC) активно прикреплялись в течение первого часа после внесения и распластывались на поверхности импланта из Ti. При культивировании через 48 часов клетки равномерно покрывали всю поверхность импланта, сохраняя при этом фибробластоподобный фенотип, выпускали большое количество длинных тонких отростков- филоподий, что увеличивало количество межклеточных контактов и контактов с имплантом, свидетельствующих о высоких адгезивных свойствах клеток на титановом импланте ( Рис .3 А.Б).
В отличие от этого на импланте из циркония активного прикрепления и роста клеток не выявлено ( Рис3 В,Г). Наблюдались одиночные округлые нераспластанные («ошаренные) клетки. Площадь соприкосновения клеток с поверхностью импланта была минимальной. При этом на дне лунки культурального планшета в присутствии импланта клетки формировали плотный монослой стромальных поточно растущих клеток, с островками многослойного роста.
А) Б)
В) Г)
Рис.3. Морфология и характер роста клеток на поверхности стоматологических имплантов. . Растровая электронная микроскопия
А, Б – 0483 Easy Fast S (General Implants GmbH, Germany) на титановой основе (Ti), В,Г – . 0297 Easy Kon (General Implants GmbH, Germany) на основе диоксида циркония (ZrO2),
Во всех экспериментах наблюдалось достаточно большое количество клеток, осевших на дно лунки и прикрепившихся к пластику. Характер роста и морфология клеток существенно не отличались и были представлены полигональными или фибробластоподобными клетками размером 8-18 μm (Рис 4). Культуры клеток характеризовалисть поточно направленным ростом. Проведенные в системе Cell-IQ исследования показали, что количество погибших клеток в присутствии обоих имплантов составляло менее 0,5% и коррелировало с показателями в контрольной культуре (0,3-0,5%).


Рис.4. Морфология hADSC через 48 часов сокультивирования в контроле 1 (А), со штифтами Easy Fast S (Ti) 0483 (Б), Easy Kon 0297 (ZrO2) (В).

Фазовая световая микроскопия
Прижизненный контроль количества клеток на единицу площади проводили в системе Cell-IQ с помощью видеокамеры. Общее количество клеток, в том числе делящихся и неделящихся, в присутствии имплантов и в контрлоле анализировали с помощью программного обеспечения Cell-IQ Analyzer. Результаты представлены в виде графиков на рисунке 5.



Рисунок 5. Изменения количества стромальных клеток на площади 1,25мм2 дна лунки планшета в присутствии образца 0297 - CrO2 (А), в присутствии образца 0483 - Ti (Б) и в контрольной культуре (В) в течение первых суток культивирования.
Как видно из рисунка 5 темпы роста клеток различались уже в течение первых суток культивирования. Через сутки в присутствии титанового образца количество стромальных клеток на проанализированном участке дна лунки площадью 1,25мм2 увеличилось на 65% (рис.5Б), что сопоставимо с контрольной культурой, где количество клеток увеличилось на 60% (рис.5В). Тогда как рост общего числа клеток в присутствии образца 0297 - CrO2 были снижены, и за сутки общее количество клеток на проанализированной площади увеличилось лишь на 13% (рис.5А). Показатели пролиферации клеток коррелируют с количеством стабильных неделящихся клеток. В течение суток общее количество клеток в присутствии образца штифта - Ti 0483 увеличилось на 62% (рис.6Б), что сопоставимо с контрольной культурой, где увеличение количества таких клеток составило 65% (рис.6В), тогда как в присутствии образца 0297 - CrO2 общее количество клеток увеличилось на 8,5% (рис.5А). Однако через двое суток (48 часов) общее количество клеток в опытных образцах и контрольной группе было сопоставимо и достигло 100%-ного конфлуэнтного монослоя (клетки покрывали плотным монослоем всю площадь дна культурального планшета). Полученные данные свидетельствуют о снижении темпов пролиферации ММСК в присутствии циркониевого образца 0297 - CrO2 в первые сутки культивирования и восстановлении пролиферации через 48 часов. Присутствие образца штифта - Ti 0483 на пролиферацию ММСК влияния не оказывает.
Остеогенную дифференцировку стромальных клеток исследовали по экспрессии маркеров остеогенеза: остеокальцина, Cbfa-1 и BMP2. Иммуноцитохимический анализ показал, что в присутствии имплантов клетки сохраняли экспрессию остеокальцина на уровне контроля 1 (Рис. 6 А). Клетки, выращенные в ростовой среде без индукторов остеогенеза (Контроль 2) остеокальцин не экспрессировали (Рис. 6 Б).


Рис.6. Экспрессия остеокальцина (зеленый) в стромальных клетках жировой ткани контрольных групп Control 1(А) и Control 2 (Б), после сокультивирования с циркониевым имплантом (В). Ядра докрашены Hoechst 33258 (синий). Лазерная конфокальная флуоресцентная микроскопия
Сохранение остеогенной дифференцировки в клетках подтверждено анализом тотальной мРНК, который выявил в экспериментальных культурах экспрессию Cbfa-1 и BMP2, сопоставимую с Контролем 1. Отсутствие экспрессии Cbfa-1 и BMP2 и наличие экпрессии контрольного гена TBP в Контроле 2 подтверждают корректность представленных результатов (Рис.7).
ADSC ZrO2 ADSC Ti ADSC Control 2 ADSC Control 1
Cbfa-1

BMP2

TBP

Рис.7. Экспрессия мРНК клетками на 2 сутки культивирования в остеоиндукционной среде со штифтами (ADSC ZrO2, ADSC Ti) и без штифтов (ADSC Control 1), в неиндукционной среде (ADSC Control 2).

ОБСУЖДЕНИЕ
Культура клеток в настоящее время рассматривается как уникальная модель для исследования качества и нетоксичности биобезопасности материалов для трансплантологии. Многочисленные исследования показали, что применение клеток, выделенных из разных тканей и органов, возможность их длительного культивирования позволяет сократить число экспериментальных животных, уменьшить сроки и стоимость доклинического исследования. Стромальные клетки жировой ткани рассматриваются как наиболее перспективные для исследования in vitro (Zuk et al., 2001).
Проведенные исследования показали, что импланты на основе титана и диоксида циркония существенно не влияли на морфологию и характер роста клеток. В экспериментальных условиях исследуемые культуры клеток сохраняли характерный для стромальных клеток жировой ткани фенотип (hADSC) и были представлены полигональными и фибробластоподобными клетками (Dubois et al., 2008). Отсутствие апоптотических и некротических телец в культуре, высокая жизнеспособность (более 99,5%) и пролиферативная активность подтвердили отсутствие цитотоксичности стоматологических имплантов. Аналогичные данные об отсутствии цитотоксичности и биобезопасности титановых имплантов других производителей были показаны ранее (Сабурина со авт., 2010, Neunzehn et al., 2012, Gittens et al., 2012).
В наших экспериментах имплант из диоксида циркония отличался низкой степенью адгезии: немногочисленные прикрепившиеся к поверхности стромальные клетки изменяли веретеновидную фибробластоподобную морфологию на округлую форму, образуя минимальный контакт с поверхностью импланта. Шероховатая поверхность импланта из титана способствовала более лучшему прикреплению и ростк клеток hADSC. Снижение общего количества клеток в лунке с образцом из циркония, возможно, обусловлено прикреплением всего количества посевных клеток на дно лунки, более быстрым формированием плотного монослоя (в течение 20-24 часов) с последующим снижением роста клеток за счет контактного торможения.
В то же время другими авторами было отмечено, что многие биоматериалы способствовали дифференцировке и миграции мезенхимальных клеток (Weyand et al., 2012, Keeve et al., 2013), а степень адгезии клеток зависела от микроструктуры поверхности биоматериала (Bauer et al., 2009), что, возможно, связано со способом обработки поверхности при изготовлении.
Также известно, что от рельефа поверхности биоматериала и его адгезионных свойств , в значительной степени зависит остеоинтеграция и остеокондуктивная активность стоматологических штифтов (Mendonça et al., 2009, Kataoka et al., 2011). В нашем случае несмотря на различие в степени адгезии клеток на своей поверхности, оба стоматологических импланта не препятствовали остеогенной дифференцировке стромальных клеток в индуцирующей среде. Это подтверждено экспрессий мРНК Cbfa-1 и BMP2 – транскрипционных факторов, связаных с ранней дифференцировкой мезенхимальных клеток в остеобласты, а также экспрессией остеокальцина на более поздних сроках культивирвоания этих клеток в индуцированной среде.

Заключение
Проведенные исследования показали отсутствие цитотоксичности исследуемых образцов стоматологических имплантов. Выысокая жизнеспособность, активный рост и миграция клеток в присутствии имплантов делают данные образцы перспективными для применения не только в стоматологии, но и в ортопедии. Различие в адгезивных характеристиках материалов для клеток, по-видимому, обусловлено ультраструктурой поверхности имплантов. Шероховатая поверхность титанового импланта способствует лучшему прикреплению и росту клеток и не препятствует остеогенно направленной дифференцировки клеток.


Список литературы:
1. Bauer S., Park J., Faltenbacher J., Berger S., von der Mark K., Schmuki P. Size selective behavior of mesenchymal stem cells on ZrO(2) and TiO(2) nanotube arrays // Integr. Biol. (Camb.). 2009. 1(8-9).P.525-32.
2. Cai K., Lai M., Yang W., Hu R., Xin R., Liu Q. et al. Surface engineering of titanium with potassium hydroxide and its effects on the growth behavior of mesenchymal stem cells // Acta Biomaterialia. 2010. 6(6).P.2314-21.
3. Dubois S.G., Floyd E.Z., Zvonic S., Kilroy G., Wu X., Carling S., Halvorsen Y.D., Ravussin E., Gimble J.M. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens // Methods Mol. Biol. 2008.449.P.69-79.
4. Egusa H., Sonoyama W., Nishimura M., Atsuta I., Akiyama K. Stem cells in dentistry-Part II: Clinical applications // J. Prosthodont. Res. 2012.56(4).P.229-48.
5. Giannoni P., Muraglia A., Giordano C., Narcisi R., Cancedda R., Quarto R., et al. Osteogenic differentiation of human mesenchymal stromal cells on surface-modified titanium alloys for orthopedic and dental implants // International Journal of Artificial Organs. 2009.32(11).P.811-820.
6. Gittens R.A., Olivares-Navarrete R., McLachlan T., Cai Y., Hyzy S.L., Schneider J.M., Schwartz Z., Sandhage K.H., Boyan B.D. Differential responses of osteoblast lineage cells to nanotopographically-modified, microroughened titanium-aluminum-vanadium alloy surfaces // Biomaterials. 2012 .33(35).P.8986-94.
7. Kataoka Y., Tamaki Y., Miyazaki T. Synergistic responses of superficial chemistry and micro topography of titanium created by wire-type electric discharge machining // Biomed. Mater. Eng. 2011.21(2). P.13-21
8. Keeve PL, Dittmar T, Gassmann G, Grimm WD, Niggemann B, Friedmann A. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate // J. Periodontal Res. 2013.48(3).P.276-85 .
9. Mendonça G., Mendonça D.B., Simões L.G., Araújo A.L., Leite E.R., Duarte W.R., Aragão F.J., Cooper L.F. The effects of implant surface nanoscale features on osteoblast-specific gene expression // Biomaterials. 2009. 30(25). P.4053-62.
10. Neunzehn J., Lüttenberg B., Wiesmann H.P. Investigation of biomaterials by human epithelial gingiva cells: an in vitro study // Head Face Med. 2012.N8. P.35-46.
11. Terheyden H., Lang N.P., Bierbaum S., Stadlinger B. Osseointegration--communication of cells // Clin. Oral Implants Res. 2012.V.23(10). P.1127-35.
12. Valencia S., Gretzer C., Cooper L.R. Surface nanofeature effects on titanium-adherent human mesenchymal stem cells // International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 2009. V.24(1). P.38-46.
13. Weyand B., Kasper C., Israelowitz M., Gille C., von Schroeder H.P., Reimers K., Vogt P.M. A differential pressure laminar flow reactor supports osteogenic differentiation and extracellular matrix formation from adipose mesenchymal stem cells in a macroporous ceramic scaffold // Biores. Open Access. 2012 .V.1(3).P.145-56.
14. Zigdon H., Levin L. Stem cell therapy for bone regeneration: present and future strategies // Alpha Omegan. 2012. V.105(1-2) .P.35-8.
15. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J.I., Futrell W.J., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cellbased therapies. // Tissue Eng. 2001. V. 7. P. 211-226.
16. Сабурина И.Н., Горкун А.А., Орлов А.А. Исследование биобезопасности, биосовместимости и остеокондуктивной активности стоматологических титановых штифтов Apolonia (Laser) и Apolonia (RBM). // Медицинский алфавит: Стоматология. – М.: ООО "Альфмед", 2010. – Т.2, №5. – С. 36-39.

 

Виртуальный тур по клинике